Entwicklungsbiologisches Praktikum


Literatur:

Johnson, L.G. 1995. Patterns & Experiments in Developmental Biology.WCB Brown Publishers

Tyler, M.S. 1994. Developmental Biology. A guide for experimental study. Sinauer Ass. Mass.

Slack, J.M.W. 1994. From Egg to embryo. Regional Specification in Early Development. Cambridge University Press

Javois, L.C. (1993) Biological features and morphogenesis of hydra. In: Morphogenesis: Analysis of the Development of Biological Structure. (E.F. Rossomando and S. Alexander, Eds.) Marcel Dekker, Inc. N.Y. pps. 93-127.

Martin, V. (1990) Development of nerve cells in hydrozoan planulae. III. Some interstitial cells traverse the ganglionic pathway in the endoderm. Biological Bulletin 178:10-20.

Shostak, S. (1991) Embryology: An Introduction to Developmental Biology. Harper Collins, New York

Shostak, S. (1993) Studies of asexual reproduction in Cnidaria. Pp 45-105 In "Reproductive Biology of Invertebrates", Adiyodi, K.G., and

R.G. Adiyodi, Ed. Wiley, by arrangement with Oxford and IBH, New Delhi


Protokolle und Dokumentation

Alle durchgeführten Versuche sind zu protokollieren, unabhängig vom erzielten Ergebnis. Die Interpretation der Ergebnisse sollte dabei sowohl tatsächliche als auch potentielle Fehlerquellen enthalten. Alle Beobachtungen (Änderungen, Abläufe) sind zeitlich, inklusive der Randbedingungen (Temperatur .... Medienwechsel) zu erfassen. Die entsprechende Dokumentation kann durch Zeichnungen, Fotografie bzw. Videosequenzen erfolgen, je nach Versuch sollte ein geeignetes Verfahren gewählt werden. Bitte beachten Sie, daß während der Versuche , unabhängig von den Versuchen selbst, für Fotos bzw. Videos entsprechende Protokolle geführt werden, die alle notwendigen Angaben enthalten (Vergrößerung, Zeit, Objekt, Name ...). Da mehrere Kameras zur Verfügung stehen: Markieren Sie Kamera/Film und zugehöriges Protokoll eindeutig. Bei Verwechslungen sind die Filme sonst wertlos ! Eichen Sie die mikroskopische Optik, bevor Sie Messungen durchführen (Objektmikrometer). Beachten Sie unterschiedliche mikroskopische Konstruktionen, für die Eichung mikrofotografischer Systeme sind Aufnahmen der Objektmikrometerskala mit den unterschiedlichen Objektiven am besten geeignet. Ändern Sie nach der Eichung keine Geräteaufbauten !


Lösungen:

Die Angaben stellen in der Regel nicht die tatsächlich benötigte Menge an Lösung etc. dar. Diese ist in Abhängigkeit von Teilnehmerzahl und Versuchsplanung entsprechend festzulegen.




Planarien


Seit dem 18. Jahrhundert ist bekannt, daß Planarien, wenn man sie halbiert oder in kleinere Teile zerschneidet, wieder vollständig (also aus jedem Stück) regenerieren können. Bereits vor etwa 100 Jahren wurde vermutet, daß ein Gradient von Substanzen die Ursache ist. Allerdings konnten derartige Substanzen nicht nachgewiesen werden - auch heute sind diese Fragen noch offen. Zwei Modelle dienen zur Erklärung von "pattern formation" bzw. "positional formation" : Diffusionsgradientenmodell und Polarkoordinatenmodell.
Planarien sind Hermaphroditen, eine sexuelle Fortpflanzung tritt selten, wenn überhaupt, als interne Befruchtung auf. Die Haltung erfolgt in Teichwasser, Leitungswasser kann auf Grund des Chlorgehalts, wogegen die Tiere sehr empfindlich sind, nicht verwendet werden. Die Fütterung wird normalerweise einmal wöchentlich mit Leber oder Eiweiß durchgeführt. Wenn die Zahl der Tiere erhöht werden soll, wird zweimal wöchentlich gefüttert. Futter sollte nach 2-3 Stunden wieder entfernt werden, um Verschmutzungen zu vermeiden. Aus diesem Grund ist auch regelmäßiger Wasserwechsel (1-2x wöchentlich) erforderlich. Der Transfer von Planarien kann mit Pipetten (Durchmesser >3 mm) oder mit weichem Pinsel erfolgen. Bei der Nutzung von Pipetten muß schnell gearbeitet werden, da die Tiere sich sonst im Innern der Pipette festsetzen. Die Regeneration beginnt relativ schnell, bei 22-24 C ist das Blastem nach etwa 1-2 Tagen schwach, nach 3-4 Tagen deutlich sichtbar, da es nicht pigmentiert ist. Nach 4-6 Tagen sind differenzierte Strukturen sichtbar, die vollständige Regeneration ist nach etwa 2-3 Wochen abgeschlossen.

Beobachtung des normalen Aufbaus Dokumentieren Sie die vorgenommenen Schnitte bzw. Manipulationen, kultivieren Sie die Teile einzeln in geeigneten Gefäßen und beobachten Sie die Regeneration. Vergleichen Sie lebende Planarien bzw. den Regenerationsprozeß lebender Planarien mit Schnitten (werden zum Teil zur Verfügung gestellt). Diskutieren Sie ihre Ergebnisse im Hinblick auf die bekannten Regenerationsmodelle.



Hydra (Cnidaria)


Hydren sind einfach organisierte, rotationssysmmetrische Lebewesen. Über eine Haftscheibe/Fuß sitzen sie an Oberflächen fest, können sich jedoch bei wechselnden Umgebungsbedingungen auch fortbewegen. Die Vorteile dieses Objekts liegen in der Einfachheit ihrer Organisation, der begrenzten Zahl von Zelltypen und vor allem dem enormen Regenerationsvermögen (selbst Nervenzellen können erneuert werden). Praktisch zu jeder Zeit sind i m mittleren Bereich Zellteilung und Zelldifferenzierung möglich. Im peripheren Bereich erreichen Zellen das Endstadium der Differenzierung, gealterte Zellen werden dort auch eliminiert. Die Zelltypen werden in Epithelzellen, welche das Grundgerüst des Polypen bilden, und interstitielle Zellen (Zellen unterschiedlicher Funktion, die zwischen Epithelzellen lokalisiert sind) unterschieden. Interstitielle Zellen im eigentlichen Sinn sind Stammzellen und ihre Abkömmlinge, die morphologisch zwar noch nicht von den Stammzellen unterschieden werden können, aber bereits eine beginnende Differenzierung in Richtung ihrer endgültigen Funktion aufweisen. Aus den interstitiellen Zellen können sich folgende Zellentypen differenzieren: Nervenzellen, Nemotocyten (mit Nematocysten), Drüsenzellen und Keimzellen.

Hydra-Server: http://128.200.5.5

Lösungen: Wright's Eosin-Methylenblau (oder Evan's Blue, Thiazinrot), Fluorescein, Hydramedium

Als Futter werden Nauplien von Artemia verwendet, diese werden in Meerwasser frisch angezogen. Die Zeit bis zum Schlupf , etwa 2 Tage, muß jeweils für eine Bereitstellung von ausreichenden Futtermengen berücksichtigt werden.

Durchführung:

1. Zelldifferenzierung: Die Haltung kann während des Praktikums in kleinen Petrischalen mit Hydramedium erfolgen. Ein gleichbleibender Zustand wird durch tägliches Füttern erreicht. Mangels geringer Farbstoffaufnahme durch lebende Hydren kann die Anfärbung nur über die Nahrungsaufnahme mit Wright's Eosin-Methylenblau oder ähnlichen Farbstoffen erfolgen (Futter 48h zuvor mit Farbstoff behandeln). Einzelne Tiere können in Hohlschliffobjektträgern beobachtet werden, ansonsten sind je nach Mikroskop Petrischalen bzw. Uhrglasschälchen geeignet. Der Transfer der Polypen kann mit Pipetten (Durchmesser > 2 mm) erfolgen.

Nach erfolgreicher Behandlung mit Mazerationslösung in Reagenzgläsern (ca. 100 l pro Hydra, mind. 30 min, eventuell über Nacht) können die Zellen vorsichtig voneinander getrennt werden. Die entstandene Zellsuspension wird fixiert (1/10 Volumen Formalin) und nach Zugabe von Detergenz (minimale Menge) auf Objektträger (beschichtet) übertragen. Die Beobachtung sollte mit Differential-Interferenzkontrast (DIC) oder Phasenkontrast erfolgen.

2. Reaggregation: Parallel zum vorangegangenen Versuch sollten weitere Hydren (einen Tag nicht gefüttert) mit Dissoziationslösung behandelt werden. Dazu werden die Tiere mehrfach mit Hydramedium gewaschen (die Polypen dürfen sich dabei nicht festsetzen) und in ein Zentrifugenglas (spitz) übertragen. Das Hydramedium wird anschließend durch 3-4 ml Dissoziationsmedium ersetzt (4 C, 30-90 min). Im Gegensatz zum vorangegangenen Versuch sollte dieses Medium mit einer Pipette gut gemischt werden (Einblasen von Luft vermeiden). Dabei sollte die die kürzestmögliche Einwirkzeit gewählt werden (-> Vitalität mit Acridinorange überprüfen) Die Hydren werden dabei durch die auftretenden Scherkräfte in Einzelzellen bzw. Fragmente zerlegt. Sobald sich das Medium trübt, wird die Suspension in eine Glasschale überführt, die langsam bewegt werden sollte. Das Sediment aus Einzelzellen sollte sich allmählich durch Aggregation zusammenballen. Größere Aggregate sollten später aufgetrennt werden. Je nach Zeitplan sollte das Medium nach einigen Stunden (spätestens am nächsten Tag) allmählich durch Hydramedium ersetzt werden.

3. Regeneration: Die für Regenerationsversuche vorgesehenen Tiere sollten knospenlos und wenigstens einen Tag nicht gefüttert worden sein. Mittels einer Kanüle werden die Tiere quergeteilt, dabei erfolgen die Schnitte jeweils unterhalb des Hypostoms, in der Körpermitte bzw. etwas oberhalb des Fußes. Die Teilungen sollten dabei so erfolgen, daß aus einigen Tieren Fragmente gleicher Größe geschnitten werden (Trennung der Körpersäule von Fuß und Tentakelkranz, halbieren).

4. Transplantation: Ähnlich dem vorangegangenen Versuch sollten auch diese Tiere knospenlos sein und einen Tag gehungert haben. Zur Fütterung wird für einige Hydren tags zuvor gefärbtes Futter verwendet, um eine Unterscheidung zu ermöglichen. Als Halterung für transplantierte Polypen werden Nadeln verwendet, welche in Paraffin eingegossen wurden (Nadeln parallel zum Schalenboden), zum Festhalten dient jeweils Silikongummi. Geeignete Transplantationen sind Kombinationen von Kopf-Kopf (das obere Drittel des Tieres jeweils) bzw. das Aufpfropfen von Ringen aus dem subtentakulären Bereich (siehe Skizze)



Beobachtungsziel:

1. Beobachten und dokumentieren Sie die verschiedenen Zelltypen, Mazerationsverlauf (Ursache, Einfluß auf Vitalität ...).

2. Hydren können in Medien mit hohem osmotischem Druck in noch vitale Einzelzellen zerlegt werden. Diese Einzelzellen können aggregieren und nach schrittweiser Überführung in normales Medium mehrköpfige Polypen bilden, welche sich nach einiger Zeit in Einzeltiere trennen. Dokumentieren Sie Dissoziation und Aggregationsverlauf. Berücksichtigen Sie dabei auch Vitalität und Differenzierung einzelner Zellen bzw. Zelltypen.

3. Beobachten Sie Regeneration der Zeitdauer bis zum Erscheinen neuer Tentakel (Zahl) bzw. zur vollständigen Ausbildung. Wie wirkt sich die Fragmentgröße auf die Regenerationsgeschwindigkeit aus

4. Transplantationsexperimente dienen zu Untersuchungen der Polarität der einzelnen Fragmente, dabei erlauben unterschiedliche Versuchsansätze auf verschiedene Modelle. Neben den eigentlichen Transplantationsexperimenten sollen die Differenzierungen von Zellen im Wundbereich (in vivo bzw. Schnitt, Zeit, Ort) verfolgt werden.



Kopf- und Fußregeneration bei der Glasrose


Hilfsmittel

Meerwasseraquarium mit Filter und Belüftung, Schere, feine Pinzetten, Präpariernadel, Objektträger, Deckgläschen, Futter (kl. Garnelen, Muschelfleisch), Färbeküvette, Petrischalen, Rasierklingen, Blockschälchen, Becherglas, Nadeln, Silikongummi

Chemikalien: Meerwasser, evtl. Urethan in Seewasser (0,5%), Färbelösungen, Mazerationsflüssigkeit (Eisessig, Glyzerin, Wasser 1 :1 :13)

Durchführung

1. Polare Organisation: Einen Teil der Glasrosen einige Tage mit gefärbten kleinen Garnelen füttern (Versuch: Janusgrün). Glasrosen quer durchschneiden (eventuell vorher mit Urethan-Seewasser betäuben). Auf einer Nadel Kopf mit gefärbtem Fuß zusammenstecken bis die Wunden Kontakt haben. Die Stücke oben und unten mit Silikongummi fixieren (schnell arbeiten, nur frische Wunden verheilen!). Einige Stunden danach Tiere wieder von der Nadel abziehen. Am nächsten Tag zweifarbige Mittelstücke herausschneiden und Regeneration täglich protokollieren (Seewasserbehälter immer abgedeckt lassen, da sich sonst durch Verdunstung die Salinität drastisch ändert. Seewasser nach Protokollierung erneuern). Auswertung: Wo wird wie häufig Kopf und Fuß gebildet (Fußregion erkennt man daran, daß sich die Tiere festsetzen können)?

2. Gradientenartige Verteilung des Regenerationsvermögens: Glasrosen in 4 Teile zerschneiden (quer). Stücke aus der gleichen Region in einer Petrischale zusammen halten. Regeneration von Kopf und Fuß täglich protokollieren.

3. Zelltypen: Glasrosenfragmente auf einen Objektträger bringen und das Wasser absaugen. Mazerationslösung dazugeben und 20 Minuten einwirken lassen, danach die Lösung so gut wie möglich absaugen. Gewebe mit einer Nadel verrühren und ausstreichen. Antrocknen lassen und 3 Minuten mit Ethanol fixieren. 5 Minuten färben, spülen mit Wasser. Nach kurzer Lufttrocknung unter Euparal betrachten. Auswertung: Suchen und dokumentieren der Zelltypen.




Zebrafish (Danio rerio)

Erstellen Sie umweltabhängige Lifetable (Licht/Temperatur) der Larvalentwicklung des Zebrafischs. Dokumentieren Sie mit größtmöglicher Genauigkeit die einzelnen Phasen der Entwicklung. Die notwendigen Protokolle finden Sie Online.

Literatur: Zebrafish-Net



Calliphora

Da die Larven deutlich größer sind, wird für die folgende Versuche nicht eines der normalen Haustiere von Entwicklungsbiologen und Genetikern, Drosophila verwendet, sondern Calliphora

Die hormonelle Umstellung, die den Übergang vom Larvalstadium zum Puppenstadium bewirkt, beginnt bei Calliphora etwa 8-14 h vor Verpuppungsbeginn. Maden dieses Vorpuppenstadiums lassen sich normalerweise von den vorherigen Stadien unterscheiden, da sie sich bei Berührungsreizen zusammenziehen (Tönnchenform). Die Larvenhäutung wird durch die gleichzeitige Ausschüttung von Juvenilhormon und Häutungshormon i nduziert, eine alleinige Ausschüttung des Häutungshormons führt zur Verpuppung.

Lösungen: Insekten-Ringer, Ecdysteron

Durchführung: 1. Durch Schnürungen lassen sich im Vorpuppenstadium Störungen der Verpuppung erreichen, die in einer unvollständigen Verpuppung resultiert und auf mangelhaften Hormontransport zurückzuführen ist. Zur Schnürung werden gelochte Gummischeibchen verwendet, die vorsichtig auf Eppendorfspitzen aufgezogen werden. Sobald eine Made in eine der so präparierten Spitzen kriecht und sich mit Kopf und erstem Segment im Spitzeninneren befindet, läßt man die Gummischeibchen von der Spitze abspringen. Der so abgeschnürte Kopf sollte sich nach etwa 24 h verpuppen, während der Hinterleib unverändert bleiben sollte. Kontrollversuche sollten mit Tieren unterschiedlichen Alters durchgeführt werden.

2. Der abgeschnürte Hinterleib wird mit verschiedenen Konzentrationen von Ecdysteron behandelt. Die Injektion erfolgt dabei nach der erfolgten Verpuppung der Kopfregion mit möglichst geringen Mengen Flüssigkeit (1-2 æl) durch die Schnürung hindurch (die sklerotisierte Kopfregion wird abgeschnitten). Die notwen digen Kontrollen werden mit ecdysonfreier Ringerlösung durchgeführt.

3. Überprüfen Sie parallel zu den vorangegangenen Teilversuchen den Einfluß von Pathogenen auf die Pupariumbildung. Zu diesem Zweck werden entomopathogene Pilze eingesetzt (Emerskulturen bzw. Submerskulturen von Verticillium lecanii bzw. Metarhizium anisopliae). Die Menge der Kontaminationen mit dem pilzlichen Pathogen kann mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen (Calcufluor) mikroskopisch bestimmt werden.

Beobachtungziel: Bei den Schnürungen treten neben den gewünschten Teilverpuppungen auch andere Varianten auf. Interpretieren Sie diese, geben Sie die möglichen Ursachen dieser Effekte an. Werten Sie die Ergebnisse statistisch aus, beachten Sie dabei die entsprechenden Alter der Tiere.

Der Einfluß von Entomopathogenen kann zu morphologischen Veränderungen, insbesondere der Kutikula, führen. Zusätzlich können infolge toxischer Belastungen bzw. Streß Verschiebungen im zeitlichen Verlauf der Larvalentwicklung auftreten. Vergleichen Sie die belasteten Untersuchungstiere mit unbelasteten Tieren in bestimmten Zeitabständen (Entwicklungsstand, Kontaminationen, Penetrationen). Worauf sind Änderungen der Pigmentierung zurückzuführen ?


Frankliniella occidentalis und Parthenothrips dracenae

Die beide zu den Thripiden gehörenden Arten unterschieden sich hinsichtlich ihrer Fortpflanzung deutlich. Die Reproduktion von P. dracenae erfolgt thelytok parthenogenetisch, die Mechanismen der genetischen Steuerung der Geschlechtsdetermination ist weitgehend unbekannt. Aus unbefruchteten Eiern entwickeln sich Weibchen, Männchen treten äußerst selten auf. Als Ursache werden fehlende Interaktion der Kerne und Fusion mit Polkörpern diskutiert. Die Geschlechtsdetermination bei F. occidentalis erfolgt arrhenotok, aus unbefruchteten Eiern entwickeln sich Männchen, aus befruchteten Eiern entwickeln sich Weibchen. Diese Art dient bei diesem Versuch als Kontrolle. Von anderen Insektenarten (Trichogramma, Muscidifurax) ist bekannt, daß die Geschlechtsdetermination vom Vorhandensein bestimmter Bakterien (Wolbachia [gehört zur Alpha-Subdivision der Proteobacteria]) beeinflußt werden kann. Diese cytoplasmatisch vererbten Mikroorganismen verursachen die Entwicklung von weiblichen Tieren aus unbefruchteten Eiern durch Veränderung des Chromosomenverhaltens während der frühen mitotischen Stadien des Ei's. Dieses kann durch Störung der Inkorporation der väterlichen Chromosomen in befruchteten Eizellen geschehen (incompatibility bacteria) oder durch die Verhinderung der Segregation der Chromosomen in den unbefruchteten Eizellen (parthenogenesis bacteria) (STOUTHAMER et al. 1993). Mit Hilfe von Antibiotika läßt sich eine normale sexuelle Reproduktion wieder herstellen. Inwieweit dies auch für P. dracenae gilt, soll mit diesem Experiment geklärt werden.

Lösungen: Stammlösungen von Ampicillin, Tetracyclin, Chloramphenicol

Durchführung: Entnehmen Sie den Stammzuchten adulte Tiere nachdem Sie Boxen für die Eigewinnung vorbereitet haben. Neben Pollen wird ein dünnflüssiges Honig-Wasser-Gemisch als Nahrungsquelle eingesetzt (Flüssigkeitsfilm zwischen Parafilmschichten). Auf den Parafilm wird zusätzlich ein Agarblock aufgebracht. Sowohl Agar als auch Nahrungsmittel wird mit unterschiedlichen Antibiotika versetzt. In der Regel werden die Eier in den Agarblock gelegt und lassen sich dort mit feinem Pinsel oder Nadel absammeln. Die weiteren Entwicklungsschritte lassen sich am besten in Kulturplatten (Greiner) beobachten. Diese Platten werden mit Blattscheiben bestückt, zur Aufrechterhaltung der notwendigen Feuchte wird Wasseragar (0.8 %)verwendet. Kontrollen der Platten sollte im vierstündigen Rhythmus geschehen.

Beobachtungsziel: Dokumentieren Sie den zeitlichen Verlauf der Entwicklung bis zum Imago, vergleichen Sie dabei die Arten, bestimmen Sie den Sexualindex. Diskutieren Sie Einfluß der Antibiotika bzw. mögliche Fehlerquellen.

Die Amphibien zeigen alle Übergänge von der Totalfurchung bis zur fast discoidalen Furchung. Normalerweise kommt es zu einer radiär-inäqualen Totalfurchung, wie auch bei Xenopus. Das Spermium kann sich nur auf der animalen Hemisphäre anheften. Nach dem Abheben der Befruchtungsmembran kann das Ei frei rotieren und orientiert sich im Schwerefeld mit der dotterbepackten vegetativen Hälfte nach unten. Dies geschieht allerdings immer zum Einschlagsort des Spermiums hin. Bei manchen Fröschen macht die damit verursachte einseitige Verlagerung der Komponenten einen Bereich des Eicortex teilweise frei von Melaninpigmenten und es erscheint der sogenannte "graue Halbmond". Bei Xenopus ist dies leider nur sehr schwer erkennbar.

Störungen des normalen Entwicklungsprozesses können beispielsweise durch Lithiumionen hervorgerufen werden, Ursache ist der Einfluß auf die Spezifität der Antwort von Zellen auf induktive Signale, insbesondere in mesodermalen Regio nen.

Lösungen: 1200 I.U. humanes Gonadotropin

0.3 M Lithiumchlorid

2%ige Lösung von L-Cystein-HCl in Amphibian-Ringer, pH 7,4

Durchführung: Männchen und Weibchen werden getrennt bei gedämpftem Licht gehalten. Zwei Tage vor dem Versuch wird dem Männchen 300 I.E. humanes Gonadotropin injiziert. Einen Tag vor Versuchsbeginn bekommt das Männchen abermals 300 I.E. Gonadotropin, das Weibchen 600 I.E. Die Gallerthülle der Eier wird mit 2% L-Cystein-HCl abgelöst und anschließend 3mal mit Ringer gespült.

1. Vor der Befruchtung werden etwa 50 ml Amphibian-Ringer auf 2 C abgekühlt. Die Befruchtung selbst wird in einem zweiten Gefäß durchgeführt, in verdünnter Ringer (10 %) bei Raumtemperatur. Die Zellen verbeliebn dort für eine Stunde. Entnehmen Sie anschließend einige Eier und transferrieren Sie diese in die gekühlte Lösung. Nach vier Minuten kann die Lösung allmählich an Raumtemperatur angepaßt werden. Gefäß abdecken und stehenlassen.

Die Embryonen (32-Zell-Stadium bis maximal 128-Zell-Stadium) werden in die vorbereitete Lithiumchloridlösung transferriert. Nach 6-8 min Einwirkung wird die Lösung durch verdünnte Amphibian-Ringer (10 %) ersetzt. Dieser Schritt wird mindestens zweimal wiederholt, um alle Reste von Lithiumchlorid zu beseitigen.

Beobachtungsziel: 1. Beobachten Sie behandelte und unbehandelte Embryonen. Achten Sie auf die Entwicklung axialer Strukturen, morphologische Unterschiede und Differenzen in der Entwicklung.


Spirostomum (Ciliat)

Spirostomum ist ein etwa 2-3 mm langer, über die ganze Oberfläche bewimperter Ciliat. Der Makronucleus erstreckt sich über etwa 2/3 der Zelle, mehrere Micronuclei sind entlang des Macronucleus im Cytoplasma angeordnet. Membranellen Cytostom, contractile Vakuole am posterioren Ende

Lösungen: Amphibian-Ringer bzw. Wasser

DAPI, Acridinorange

Durchführung: Ciliaten in Hohlschliffobjektträgern (zusätzlich feuchte Kammer nach der Manipulation) beobachten

Trennung mit Hilfe feiner Nadeln

Fluoreszensfärbung mit DAPI bzw. Acridinorange (nur einige Teile)

Beobachtungsziel: Verhalten (Bewegung (Dauer, Richtung), Membranellen, Nahrungsauf- nahme), Zahl Micronuclei und Größe von Macronuclei bestimmen

Ausbildung neuer Zellmembran

Beobachten des Reorganisationsprozesses (FL, POL), Orientierung der Fragmente (ausgeprägtes posteriores Ende)

Lage/Entstehung der contraktilen Vakuole in einzelnen Fragmenten


Caenorhabditis elegans

C. elegans, ein Bodennematode, wurde 1965 von BRENNER als Versuchstier für entwicklungsbiologische Arbeiten und Untersuchungen am Nervensystem isoliert. Dieser Hermaphrodit (einige wenige Männchen mit XO treten auf) läßt sich auf E. coli-Platten halten, ist mit 3 Tagen geschlechtsreif. Infolge von Selbstbefruchtung lassen sich Stämme aus einzelnen Tieren ziehen (bis zu 300 von einem Ausgangstier), Kreuzungen der F1 sind daher unnötig.

Die Entwicklung verläuft relativ schnell, bei 22 C dauert es nur etwa 14 h bis zur Häutung (558-Zell-Stadium). In den ersten 6 Stunden erfolgen schnelle Zellteilungen, danach erfolgen kaum Zellteilungen, dafür aber deutliche Differenzierungen und Gestaltsänderungen. Ab dem 30-Zell-Stadium erfolgt die Eiablage. Bis zum Erreichen einer Endzahl von 959 somatischen Zellen durchlaufen diese Nematoden 4 weitere Stadien, unterbrochen durch Häutungen.

Versuch: Markierung von einzelnen Zellinien durch Manipulation in frühen Stadien

Unterbindung von Pseudoteilungen durch Inhibitoren

Zerstörung einzelner Zellen (DNase-Injektion,

Beobachtungsziel:Struktur des Ei's (P-Granules, Microtubuli), Rearrangements, Pseudoteilung

(Störung durch MF-Inhibitoren möglich)

dorsoventrale Polarität ab 4-Zell-Stadium

Zellinien (Muskelzellen, Keimbahn)